En 1954, il travaillait comme soigneur d’animaux de laboratoire. C’est à cette époque que le Dr Robert Goetz, cardiologue et chercheur, remarqua les aptitudes exceptionnelles de Naki. Il lui apprit à disséquer les animaux et à les préparer à la chirurgie. Naki devint ensuite technicien au laboratoire de recherche de la faculté de médecine. Au fil du temps, il apprit à pratiquer des transplantations sur les animaux. Cela le conduisit à travailler avec le professeur Christiaan Barnard, le premier chirurgien à avoir réalisé une transplantation cardiaque chez l’homme.
La carrière de Naki a décollé au plus fort de l’apartheid. En tant que Noir/Africain, il n’était pas autorisé à travailler dans la salle d’opération, qui était réservée aux Blancs/Occidentaux. La loi interdisait aux professionnels de santé Noirs/Africains d’avoir tout contact avec les patients Blancs/Occidentaux. La contribution de Naki a consisté en le développement et la recherche de nouvelles procédures chirurgicales. Hamilton Naki n’était pas présent lorsque, le 3 décembre 1967, une équipe chirurgicale dirigée par Christiaan Barnard a prélevé le cœur d’une donneuse décédée, Denise Darvall, et l’a transplanté au receveur Louis Washkansky. C’était une première mondiale. Selon le Heart of Cape Town Museum, créé en hommage à ceux qui ont joué un rôle majeur dans la transplantation d’organes, la carrière de Naki auprès de Chris Barnard a débuté par l’anesthésie d’animaux.
Ses performances exceptionnelles lui valurent une promotion au poste d’assistant chirurgical principal au laboratoire. Un article du Bulletin du Collège royal des chirurgiens d’Angleterre, paru en 2014, indique que Naki avait anesthésié le chien lors de précédentes expériences de chirurgie cardiaque en laboratoire, consistant à réaliser un pontage à cœur ouvert à l’aide d’une pompe externe. À ce titre, il a fait partie de l’équipe qui a ouvert la voie à la découverte majeure de Barnard. « Cependant, diverses sources, et notamment le fils d’Hamilton Naki, affirment qu’il a participé à la première transplantation cardiaque ».

